Abstract:

Versione in italiano:

OBIETTIVI Miriamo a: 1) convalidare e mappare nella cascata metastatica 20 geni candidati per la metastasi del cancro al seno selezionati tramite schermi genomici funzionali, utilizzando una piattaforma dedicata di xenotrapianto su zebrafish (ZebXen); 2) ottimizzare la nostra piattaforma ZebXen per la transcriptomica e metabolomica a singola cellula delle cellule tumorali durante la metastatizzazione; 3) analizzare l'interazione delle cellule tumorali con il sistema immunitario innato dell'ospite.
BACKGROUND La malattia metastatica è la principale causa di morte legata al cancro. La scarsità di farmaci anti-metastatici efficaci è dovuta principalmente ai modelli preclinici attuali per lo sviluppo di farmaci, che si concentrano principalmente sul targeting della crescita del tumore primario (PT). La metastatizzazione, invece, include molteplici passaggi biologicamente distinti, come la migrazione/invasione nel PT, l'intravasazione e l'estravasazione, la semina in siti distanti, la formazione di micro-metastasi e la crescita metastatica. Dal punto di vista meccanico, le evidenze emergenti suggeriscono che la metastatizzazione non sia un fenotipo selezionato geneticamente, ma il risultato della capacità delle cellule tumorali di adattarsi ai diversi ambienti che incontrano durante la disseminazione.
IPOTESI DI LAVORO Gli attuali modelli in vivo su topo non sono ideali per selezionare geni metastatici in quanto non consentono di esaminare i vari stadi della metastatizzazione, eccetto in condizioni sperimentali sofisticate e dispendiose in termini di tempo. Proponiamo il xenotrapianto di cellule tumorali umane in larve di zebrafish come sistema per mappare rapidamente le funzioni specifiche dei geni candidati nella cascata metastatica (piattaforma ZebXen).
PIANO SPERIMENTALE Utilizzando tecnologie di imaging in vivo ed ex vivo e una linea di zebrafish con vasculatura fluorescente, quantificheremo tutti i passaggi della cascata metastatica. 1) Metteremo alla prova la piattaforma ZebXen con 20 geni candidati per la metastasi identificati attraverso schermi genomici funzionali effettuati nei nostri laboratori; 2) Ottimizzeremo la piattaforma ZebXen per recuperare cellule viabili da ogni stadio di metastatizzazione per analisi di transcriptomica e metabolomica a singola cellula, al fine di esplorare i fenotipi associati ai diversi passaggi della metastatizzazione; e 3) Sfrutteremo la piattaforma ZebXen per analizzare l'interazione tra le cellule tumorali umane e le cellule di immunità innata dell'ospite (mieloidi). Le larve di zebrafish sono completamente competenti per l'immunità innata e le cellule dell'immunità innata larvale hanno vie di segnalazione conservate che interagiscono fisicamente e funzionalmente con le cellule tumorali trapiantate. Utilizzando una linea di zebrafish con cellule mieloidi fluorescenti, imaging a singola cellula e transcriptomica, esploreremo i meccanismi di fuga delle cellule tumorali dall'immunità innata durante la metastatizzazione, incluso il riprogrammazione trascrizionale delle cellule mieloidi dell'ospite.
CONCLUSIONI Dal punto di vista tecnologico, forniremo alla comunità scientifica uno strumento utile per studi di ricerca traslazionale. Dal punto di vista scientifico, l'identificazione di geni e meccanismi specifici per ogni stadio della cascata metastatica, che sarà fondamentale per avviare programmi di scoperta/sviluppo di farmaci mirati.

English version:

AIMS We aim to 1) validate and map in the metastatic cascade 20 candidate breast cancer metastasis genes selected through functional genomics screens, using a dedicated Zebrafish xenografts (ZebXen) platform; 2) optimize our ZebXen platform for single-cell transcriptomics and metabolomics of cancer cells during metastatization; 3) analyze cancer cell interaction with the host innate immune system.
BACKGROUND Metastatic disease is the major cause of cancer-related death. The paucity of effective anti-metastatic drugs is mainly due to current preclinical models of drug development that mostly point to the targeting of primary tumor (PT) growth. Metastatization, instead, includes multiple and biologically distinct steps, such as migration/invasion in the PT, intra- and extravasation, seeding at distant sites, micro-metastasis formation and metastasis outgrowth. Mechanistically, emerging evidence suggest that metastatization is not a genetically selected phenotype but the result of cancer cell ability to adapt to the different environments cells encounter during dissemination.
WORKING HYPOTHESIS Current in vivo mouse models are not ideal to select metastasis genes as they do not enable dissection of the various metastatization stages, except in sophisticated and time-consuming experimental conditions. We propose xenotransplantation of human cancer cells in zebrafish larvae as a system to quickly map specific functions of candidate genes in the metastatic cascade (ZebXen platform).
EXPERIMENTAL PLAN Using in vivo and ex vivo imaging technologies and a zebrafish strain with fluorescent vasculature, we will quantify all the steps of the metastatic cascade. We will 1) challenge the ZebXen platform with 20 candidate metastasis genes identified by functional genomic screens performed in our labs; 2) optimize the ZebXen platform to retrieve viable cells from each metastatization stage for single-cell transcriptomics and metabolomics analyses, in order to explore the phenotypes associated with the different steps of metastatization; and 3) exploit the ZebXen platform to analyze interaction between human cancer cells and host innate immunity (myeloid) cells. Zebrafish larvae are fully competent for innate immunity and cells of larval innate immunity have conserved signalling pathways and physically and functionally interact with grafted tumor cells. By using a zebrafish line with fluorescent myeloid cells, single-cell imaging and transcriptomics, we will explore mechanisms of cancer cell escape of innate immunity during metastatization, including transcriptional reprogramming of host myeloid cells.
CONCLUSIONS From a technological point of view, we will provide the scientific community with a useful tool for translational research studies. From a scientific perspective, the identification of genes and mechanisms specific for each stage of the metastatic cascade, which will be critical to start focused drug discovery/development programs.

Contatti: marco.giorgio@unipd.it